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小鼠溶质转运家族18,成员1蛋白(Slc18a1) ELISA 试剂盒

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测，使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似，可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物（如肽、蛋白、抗体和小分子）。抗体对分析物产生特异性，并且一部分（如辣根过氧化物酶 [HRP]）直接或间接偶联抗体，从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份，可以让终端用户调整适当的检测，以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

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直接 ELISA

在直接 ELISA 中，抗原直接结合微孔板表面，随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之，实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止检测抗体出现非特异性结合。接下来，添加直接偶联某种酶（如 HRP）的检测抗体。该检测抗体将结合抗原，并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限，可让实验设置整体简化。

直接法优缺点：

优点：1：快速，仅使用一种抗体且步骤较少；2：消除了 抗体的交叉反应性。

缺点：1：一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响；2：为每个特定的ELISA系统标记一抗，既费时又昂贵；3：由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度；4：抗原的固定化不是特异性的，有较高背景干扰。

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间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA；但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止结合抗体出现非特异性结合。第三，添加一种抗原特异性结合抗体，短暂孵育后，用缓冲液洗涤板孔，以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测，其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验，前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号，因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加，实验步骤通常会耗时更长，并且更容易出错。此外，背景信号可能会增强，因为所需的试剂数量更多，每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点：

优点：1：可以在一个物种中制备许多一抗，并且可以将相同的标记二抗用于检测；2：由于没有标记，保留了 抗体的 免疫反应性；3：高标记的二抗密度可实现高灵敏度，从而导致信号放大。

缺点：1：二抗可能会发生交叉反应，从而导致非特异性信号；2：这个过程中需要一个额外的孵育步骤

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夹心法 ELISA

在夹心 ELISA 中，抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中， 抗体被吸收进入微孔板孔中，在洗涤和封闭后，添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的 抗体。这种 抗体通常偶联某种酶，因此它可用来检测。洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂反应孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

夹心法优缺点：

优点：1：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；2：适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；3：灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

缺点：1：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位：2：价格较贵，时间消耗多。

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA，它对干扰预计信号的程度进行定量，以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶，并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标，则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合，从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点：

优点：1：灵敏度高以及灵活性高；2：能测定微量的分析物。

缺点：1：特异性较低；2：需要酶标记的抗原。

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ELISA的样本实验准备
在收集样本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的， -71℃冻存备用。标本
2. 血浆：
应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
3. 尿液：
用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
4. 细胞培养上清：
检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
5. 培养细胞
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
6. 组织标本
切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

90分钟一步法ELISA试剂盒：
1.高效，灵敏，特异的抗体
2.稳定的重复性和可靠性
3.吸附性能好，空白值低，孔底透明度高和固相载体

4.适用血清，血浆，组织匀浆液，细胞培养上清液，尿液等多种标本型

操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

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